厌氧菌培养方法、结核杆菌生长现象观察、抗酸染色浅谈

厌氧菌是自然界中分布广泛、性能独特的一类微生物, 专性厌氧菌因其细胞内缺乏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶或过氧化物酶,因此无法消除机体在有氧条件下产生的有毒产物——超氧阴离子自由基,故这类微生物极易受氧毒害。专性厌氧微生物即使短暂地把它暴露于空气中,也会引起损伤致死。因此对它们进行分离、培养和研究时,就必须有一套相应的培养分离方法。 目的要求 
1、了解厌氧菌培养常用方法:疱肉培养法、焦性没食子酸法、厌氧罐法、厌氧箱法、厌氧培养袋法等。 
2、掌握结核杆菌的形态特点,熟悉结核杆菌的培养特性。 3、掌握抗酸染色的原理及操作过程。 
4、了解结核杆菌标本的采集、培养前处理及制片。  材料  
疱肉培养基、厌氧罐、厌氧箱、厌氧培养袋、焦性没食子酸、NaOH、脱脂棉等 内容与方法 
厌氧菌培养方法:包括物理、化学和生物学方法(总之为厌氧菌培养形成一种无氧环境)  1. 厌氧罐法: 
厌氧产气袋加入水后会产生氢气和二氧化碳,氢气在厌氧催化剂(冷触酶钯粒钯粒由粉红色变成浅兰色而失效,160℃2h,即可恢复其活力而重复使用)的作用下,与氧结合生成水,可在30分钟内将氧含量降至1%以下。二氧化碳可以促进厌氧菌的生长。罐内放有煮沸去氧的美兰指示剂一管。 [每次要新鲜配制,在试管内将亚甲蓝(0.5%亚甲蓝3 ml加水至100 ml)、6%葡萄糖和氢氧化钠(1/10 mol/L NaOH 6 ml加水至100 ml)3种溶液等量混合并煮沸还原至无色,立即将指示剂管放入预先装好培养物的罐内 。如果能在孵育的整个过程中维持厌氧条件,则指示剂溶液将无色,否则指示剂则变色。亚甲蓝有氧为蓝色,无氧为无色。] 亚甲蓝作为一种氧化还原指示剂。 2.焦性没食子酸法: 
焦性没食子酸+NaOH→焦性没食子橙(黑、褐色)[吸收游离的氧气]。 培养皿法用培养皿盖,铺上一薄层灭菌脱脂棉,将1g焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板,待凝固稍干燥后,在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌,下一半划线接种荧光假单胞菌,并在皿底用记号笔作好标记。滴加10%NaOH溶液约0.5ml于焦性没食子酸上,切勿使溶液溢出棉花,立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养皿盖上,必须将脱脂棉全部罩住,焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触,以溶化的石蜡 密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处。置37℃温箱培养24~48h。   3.厌氧培养箱法: 
由厌氧环境操作箱、恒温培养箱、高度真空传递箱等组成,能任意输入所需气体,准确调节流量,以满足厌氧菌生长需要。.
原理 
分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。 材料 
酒精灯、玻片、结核病人痰液、石碳酸复红、盐酸酒精、碱性美兰等 步骤 
1.取开放性肺结核病人的痰液涂片,自然干燥后,通过火焰固定。 2.初染:痰膜上加一小的方形吸水纸,在吸水纸上滴加石炭酸复红染液,在火焰高处徐徐加温至冒蒸气,并维持 5 分钟(注意切勿让染液沸腾或煮干),当染液蒸发减少时,需再加染液补充。待标本片冷却后水洗。 
3.用 3% 盐酸酒精脱色,至无红色染液流下为止(反复2~3次,一般需要1~2min)水洗。 
4.复染:用碱性美蓝复染 1 分钟,水洗,吸干,镜检。抗酸杆菌呈红色,背景及非抗酸菌呈蓝色。

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