厌氧微生物的分离与培养浅谈

一、实验目的 

掌握Hungate厌氧操作技能，掌握厌氧微生物的培养基配制和厌氧菌的富集、分离和纯化方法。 

二、知识背景 

产甲烷菌（Mathanogens）是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的**后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。 

产甲烷菌是一类严格的厌氧细菌，**今还未发现产甲烷菌具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，产甲烷菌不能除去在生命代谢过程中产生的超氧化物、过氧化氢等氧化产物，这些氧化物可损害组成细胞的大分子，如F420因子，当F420处于氧化态时，即与酶蛋白分离而失活。因此，在对甲烷菌进行分离、培养以及操作过程中必须给予无氧的环境。 

产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。 

三、原理 

产甲烷菌是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。它生长的氧化还原电位约为-0.33V，一般**适生长温度为30～40℃，**适pH为6.0～7.2。例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；产甲烷菌生长需要的营养与其它微生物一样，需要碳源、氮源、无机盐、生长因子等。生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。 

四、实验药品、器材 1、药品 

NH4Cl、MgCl2·6H2O、K2HPO4、KH2PO4、甲酸钠、乙酸钠、胰化酪蛋白、酵母膏、盐酸半胱氨酸、刃天青、Na2S·9H2O、NaHCO3、氨三乙酸、MgSO4·7H2O、MnSO4·2H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、ZnSO4·7H2O、KAl（SO4）2·12H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2SeO3·5H2O、生物素、叶酸、盐酸吡哆醇、二水盐酸硫胺、核黄素、烟酸、D-泛酸钙、维生素B12、对氨基苯甲酸、硫辛酸。 

2、仪器用具 

装有分压表和相应高纯气体的氮气钢瓶，氢气钢瓶，二氧化碳钢瓶，铜柱和铜柱固定架，高压灭菌锅，厌氧管（15mL），厌氧瓶（50mL），异丁烯橡胶塞、光波炉、三角烧瓶（500mL、1000mL）、各种规格的定量注射器（1mL、2mL、5mL），9#针头，酒精灯，酒精棉球，水样取样器、恒温水浴锅、恒温培养箱，荧光显微镜，气相色谱仪等。3、试剂及配制 

（1）1%Na2S溶液  精确称取1克Na2S 9H2O置于100mL厌氧瓶中，加入99mL无氧无菌水。 

（2）10% NaHCO3溶液  精确称取10克NaHCO3置于100mL厌氧瓶中，加入90mL无氧无菌水。 

（3）0.1%的刃天青溶液  精确称取0.1克刃天青，用无水乙醇适量充分溶解后，用100mL容量瓶定容**100mL。 

4、材料 

厌氧消化器沉积物。 四、实验方法 

(一)无氧N2、H2、CO2的制备 1、原理 

运用Hungate铜柱除氧系统获得无氧气体。铜柱是一个内部装有铜丝（单质Cu呈亮黄色，CuO呈黑黄色）的硬质玻璃管。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。此管的大小为直径40mm，长约400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带。加热带通电温度升**约350℃时，向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的O2结合形成H2O，而CuO被还原成了Cu，铜柱内的Cu呈现明亮的黄色。当来自钢瓶含有微量O2的N2、CO2、H2通过铜柱时，Cu和气体中的微量O2化合生成CuO，气体中微量的氧气被消耗掉，从出管口出来的则为无氧气体，而铜柱则由明亮的黄色逐渐变为黑色。应用无氧气流驱赶厌氧管或厌氧瓶中的空气从而获得无氧环境。反复上述过程，铜柱则可反复使用。 

2、方法 

（1）打开Hungate铜柱除氧系统的的通气橡皮管的止水夹子，开启氢气钢瓶并形成气流，流出的氢气用橡皮管引出室外，接通电热套电源，大约20min后，铜柱温度能达到350℃左右，铜柱内的铜丝被氢气还原，由黄黑色变为纯铜铮亮色（CuO＋H2   

Cu＋H2O），当铜柱里面的水蒸气被排出完全后，可关闭氢气钢瓶，压力表指针降为零，铜柱还原结束。用止水夹子将通气橡皮管密闭待用。 

（2）当需要使用无氧氮气时，打开氮气钢瓶，气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜，并随时注意气流是否足够。此时铜柱内的铜丝处于还原态的单质铜，当通入高纯氮（99.999%）时，其中所含的极微量氧与单质铜反应，被固定下来（形成氧化铜），同时柱内会产生水蒸气，氧化铜与氢气反应所致，流出铜柱的则是无氧氮气。使用完毕后，先关紧氮气钢瓶，使压力表的指示针回**零位，接着用止水夹封闭所有橡皮管。无氧氢气、二氧化碳的使用方法相同。 

注意：在进行铜柱还原通氢气的时候必须打开窗户，一定熄灭操作台边上所有明火，包括酒精灯和电炉，操作室内不得有明火（如抽烟、使用火柴、火机等）。 #p#分页标题#e#

(二)无氧无菌水的配制 

1、将500mL一定浓度的NaCl水溶液（防止稀释时细胞涨破）沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的1000mL三角烧瓶中（选择合适的圆底烧瓶，水不可太满，否则水沸腾时容易溅出），**好放入几个防爆玻璃珠。向500mL水中加入终浓度为0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5mL 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(终浓度0.5‰)。在烧瓶外壁溶液水平面处划一刻度后，加入适量水（因为蒸发会损失部分水分）。煮沸5～10min（视所加水总量而定），刃天青会根据水中含氧量的下降经历紫色-红色-无色的颜色变化，当溶液变为无色后，再煮沸5min，然后通高纯氮气1-2min（赶走空气）。 

2、分装的过程可以不用继续加热，用10mL的定量注射针筒抽进氮气流，再打出（三次以上）洗气，然后抽取9mL无氧水注入已换气的15mL厌氧管中（抽取注射过程中应迅速利落，与空气接触时间应缩****短）；注入厌氧管后，需要等待通气5s～10s，以置换瓶中空气，在抽出氮气流针头的同时塞紧异丁烯橡胶塞（操作要*：抽出针头时要注意，橡胶塞应该先半扣到瓶口，然后用右手食指揿住，左手捏住通气针头慢慢抽出针头，橡胶塞可能会外翻导致漏气等，此时将针头往瓶内伸使塞子恢复原样，有时需要反复多次，视塞子大小而定，**后拔出针头，拔出同时立即将塞子塞进管口），**后旋紧盖子。 

3、上述无氧水经121℃高压蒸汽灭菌20min后则获得无氧无菌水。 （三）厌氧菌液体培养基配制（以制备1000mL为例）

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