厌氧微生物培养技术的目的和原理介绍

对简单,可用于那些对厌氧要求相对较低的一般厌氧菌的培养,如碱性焦性没食子酸法、厌氧罐培养法、庖肉培养基法等。本实验将主要介绍这三种,它们都属于最基本也是最常用的厌氧微生物培养技术。其中有些厌氧微生物要求高的培养研究,对实验仪器也有较高的要求,如主要用于严格厌氧菌分离和培养的亨盖特技术、厌氧培养箱(手套箱)法等。厌氧培养箱已逐渐普及,本实验也作简要介绍。 
1.碱性焦性没食子酸法 
焦性没食子酸与碱溶液(NaOH、Na2CO3或NaHCO3)作用后形成易被氧化的碱性没食子盐,能通过氧化作用而形成黑、褐色的焦性没食子橙从而除掉密封容器中的氧。这种方法的优点是无需特殊及昂贵的设备,操作简单,适用于任何可密封的容器,可迅速建立厌氧环境,适用于前期实验性探索研究;而其缺点是在氧化过程中会产生少量的一氧化碳,对某些厌氧菌的生长有抑制作用,同时,NaOH的存在会吸收掉密闭容器中的二氧化碳,对某些厌氧菌的生长不利。用NaHCO3。代替NaOH,可部分克服二氧化碳被吸收问题,但却又会导致吸氧速率的降低。当然,大批量厌氧培养需消耗大量实验药品,并产生大量废液,可能引起环境污染。 
2.厌氧罐培养法 
利用一定方法在密闭的厌氧罐中生成一定量的氢气,而经过处理的钯或铂可作为催化剂催化氢与氧化合形成水,从而除掉罐中的氧而造成厌氧环境。由于适量的CO2(2%~10%)对大多数的厌氧菌的生长有促进作用,在进行厌氧菌的分离时可提高检Ⅲ率,所以一般在供氢的同时还向罐内供给一定的CO2。厌氧罐中H2及CO2的生成可采用钢瓶灌注的外源法,但更方便的是利用各种化学反应在罐中自行生成的内源法,例如,镁与氯化锌遇水后发生反应产生氢气,碳酸氢钠加柠檬酸水后产生CO2: 
Mg+ZnCl2+2H2O→MgCl2+Zn(OH)2+H2↑ C6H8O7+3NaHCO3→Na3(C6H5O7)+3H2O+3CO2↑
厌氧罐中使用的厌氧度指示剂一般都是根据亚甲蓝(methylene blue)在氧化态时呈蓝色而在还原态时呈无色的原理设计的。目前,厌氧罐技术早已商业化,有多种品牌的厌氧罐产品(厌氧罐罐体,催化剂、气体发生袋、厌氧指示剂)可供选择。它实际上已经同厌氧培养箱类似,但因为体积小、携带方便,使用起来十分方便。图3—13显示了一般常用的厌氧罐的基本结构。
3.庖肉培养基法 
碱性焦性没食子酸法和厌氧罐培养法都主要用于厌氧菌的斜面及平板等固体培养,而庖肉培养基法则在对厌氧菌进行液体培养时最常采用。该方法基本原理是,将精瘦牛肉或猪肉经剁切、煮干、密闭保存处理后配成庖肉培养基,其中既含有易被氧化的不饱和脂肪酸能吸收氧,又含有谷胱甘肽(GSH)等还原性物质可形成负氧化还原电势差,再加上将培养基煮沸驱氧及用石蜡凡士林封闭液面,可用于培养厌氧菌。这种方法是保藏厌氧菌,特别是厌氧的芽孢菌的一种简单可行的方法。若操作适宜,比如额外添加100μg/ml。的新霉素,严格厌氧菌都可获得生长。 
4.厌氧培养箱(手套箱)法 
同以上三种方法相比,厌氧培养箱(图3一14)的厌氧环境最高,非常适用于培养绝对厌氧微生物。该方法的优点是提供一个大的厌氧培养空间,保证高度无氧环境,由于系统的高度集成,无需上述方法的复杂操作过程,无大量化学废物产生。该方法的工作原理是注入氢气H2透过钯[钯催化剂片或钯桶(带热量)]催化氢氧化合作用把腔内的氧气化成水,除去氧O2 

因此氧浓度很低。产生的水蒸气通过系统的干燥管进行干燥。从而达到手套箱内干燥的效果,也同时减少系统操作台内的氧气的含量。上述化学反应中的热量和催化剂钯是系统构造中的加热器来完成的,如图3一14所示。 
气阀的作用是在使用前,充进惰性气体的人口,常充进的惰性气体有氮气(85%)、氢气(10%)和二氧化碳(5%),通过真空泵的往复抽吸置换,达到了痕量氧的环境。 
注意:混合气体的成分根据需要而定。其中二氧化碳的主要功能是提供厌氧培养需要的气源,氢气用于除氧,氨气用于保持厌氧培养箱的无氧氛围。 

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