厌氧微生物的培养

一、实验目的和内容 
目的:学习培养厌氧微生物的方法,了解厌氧微生物生长的特性。 内容:1、深层穿刺法,厌氧培养丙酮丁醇梭菌。 
2、真空干燥器厌氧培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。 3、针筒厌氧法培养丙酮丁醇梭菌及产气荚膜梭菌。 4、厌氧罐培养法示范。 
5、厌氧袋法培养丙酮丁醇梭菌。 二、实验材料和用具 
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。 RCM培养基(即强化梭菌培养基)、TYA培养基、玉米醪培养基、中性红培养基、明胶麦芽汁培养基。CaCO3,焦性没食子酸(即邻苯三酚)、Na2CO3,10%NaOH溶液,0.5%美蓝水溶液,6%葡萄糖水溶液,钯粒(A型),NaBH4,KBH4,NaHCO3,柠檬酸。 
带塞或塑料帽玻璃管(直径18~20mm,长180~200mm),1mL血浆瓶,250mL血浆瓶,2OmL和50mL针简,250mL三角瓶,试管,厌氧罐,厌氧袋(不透气的无毒复合透明薄膜塑料袋,14cm×32cm),培养皿,真空泵,带活塞干燥器,氮气钢瓶。 三、操作步骤 
(一)真空干燥器厌氧培养法 
此法不适用于培养需要CO2的微生物。该法是在干燥器内使焦性没食子酸与氢氧化钠溶液发生反应而吸氧,形成无氧的小环境而使厌氧菌生长。 
1.培养基准备与接种  将3支装有玉米醪培养基或RCM培养基的大试管放在水浴中煮沸l0min,以赶出其中溶解的氧气,迅速冷却后(切勿摇动)将其中2支试管分别接种丙酮丁醇梭菌和产气荚膜梭菌。 2.干燥器准备与抽气   在带活塞的干燥器内底部,预先放入焦性没食子酸粉末20g和斜放盛有200mL10% NaOH溶液的烧杯。将接种有厌氧菌的培养管放入干燥器内。在干燥器口上涂抹凡士林,密封后接通真空泵,抽气3~5min,关闭活塞。轻轻摇动干燥器,促使烧杯中的NaOH溶液倒入焦性没食子酸中,两种物质混合发生吸氧反应,使干燥器中形成无氧小环境(图18-lA) 3.观察结果  将干燥器置于37℃恒温箱中培养约7d,取出培养管,分别制片观察菌体特征。 (二)深层穿刺厌氧培养法 
此法操作简单,适用于一般厌氧微生物的活化和分离培养,但不能用于扩大培养。 
1.接种培养   将玻璃管一头塞上橡胶塞,装入培养基(RCM或TYA培养基)的高度为管长的2/3,套上塑料帽或橡皮塞,灭菌并凝固后,将丙酮丁醇梭菌用接种针穿刺接种(图18—lB),置37℃恒温箱中培养6~7d。 
2.观察结果   观察菌落形态特征并制片于显微镜下观察菌体的细胞形态,并记录结果。 (三)针筒厌氧培养法 
此法适于活化厌氧菌和小体积的扩大培养。 1.培养基准备   将灭菌的装有RCM或TYA培养基的血浆瓶放在沸水浴中加热10min,在瓶口胶塞上插上2枚医用针头排气,以赶出残留在培养基内的氧气。随后将血浆瓶从沸水浴中取出,再用氮气钢瓶中的高纯氮气(99.99%)通过胶塞上的一枚针头引人血浆瓶中,使血浆瓶内充满氮气,瓶内培养基在冷却过程中保持无氧状态。 2.针筒装灌培养基   将灭菌的针筒接上针头经胶塞刺人血浆瓶中,先利用瓶内氮气的压力将针筒的推杆慢慢推开,待吸入一定体积的氮气后取下针筒,排尽针筒内的气体。按此重复操作3次,以排尽针筒内的残留空气而维持无氧状态。使血浆瓶口朝下倾斜,利用瓶内压力将培养液缓慢注入针筒内,然后取下针筒,用经灭菌的带孔橡皮塞迅速把针筒头部塞住(图18-2)。 
3.接种培养采用无菌操作以菌种液针筒将菌穿刺接入培养液针筒中(图18-3),置37℃恒温培养,用于菌种活化可培养16~18h,用于测定菌体生长可培养6~7d。 4.观察结果取菌制片观察。 (四)厌氧罐培养法 
此法利用透明的聚碳酸酯硬质塑料制成的一种小型罐状密封容器,采用抽气换气法充入氢气,利用钯作催化剂与罐内氧气发生作用达到除氧的目的,同时充入10%(V/V)的CO2以促进某些革兰氏阴性厌氧菌的生长(图18-4)。 其实验操作过程如下: 1.制备厌氧度指示剂  取3mL0.5%美蓝水溶液用蒸馏水稀释至100mL;6mL0.1mol/LNaOH溶液用蒸馏水稀释至l00mL;6g葡萄糖加蒸馏水至l00mL。将上述3种溶液等体积混合,并用针筒注入安瓿管内lmL,沸水浴加热至无色,立即封口即成。取一根直径1cm、长8cm的无毒透明塑料软管,将装有美蓝指示剂的安瓿管置于软管中,制成美蓝厌氧度指示管。 2.培养基准备与接种   将制成无菌无氧的RCM或TYA培养基平板,在无菌操作下迅速划线接种丙酮丁醇梭菌或产气荚膜梭菌,并立即将平皿倒置放入已准备好的厌氧罐中,同时放入一支美蓝厌氧指示剂管。随后及时旋紧罐盖,达到完全密封。 
3.抽气换气   将真空泵接通厌氧罐抽气接口(图18-4),抽真空至表指针0.09~0.093MPa(680~700mmHg柱)时,关闭抽气口活塞,用止血钳夹住抽气橡皮管。打开氮气钢瓶气阀向厌氧罐内充入氮气,当真空表指针返回到零位终止充氮。再接上述步骤抽气和充入氮气,如此重复2~3次,使罐中氧的含量达最低度。最后充入的氮气使真空表指针达0.02MPa(l60mmHg)时停止充氮气。再开启CO2钢瓶阀门,向罐内充入CO2直至真空表指针达到0.011MPa(80mmHg)时停止。为除尽罐内残留的氧,以氢气袋(用医用“氧气袋”灌满氢气)气管连接向厌氧罐内充入氢气直至真空表指针回到零位为止。充气完毕,封闭厌氧罐。 

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