厌氧微生物的分离与培养介绍

一、实验目的 
熟练掌握Hungate厌氧操作技能,了解和掌握厌氧微生物的培养基配制,并进行分离纯化。 二、实验用具 
装有分压表的氮气钢瓶,氢气钢瓶,调压变压器,铜柱和铜柱固定架,高压灭菌锅,厌氧管(15ml),厌氧瓶(50ml),异丁烯橡胶塞、电炉、圆底烧瓶(500ml、1000ml)、各种规格的定量注射器(1ml、2ml,5ml),18#针头,酒精灯,酒精棉等。 
三、实验操作 
(一)、高纯无氧N2的制备 
1、  接通电源:把输出电压缓缓从0伏分级升到50~90伏之间(调电压的过程持续大约2-3s就可以了)。大约20
分钟后,铜柱温度能达到350℃左右(输出电压禁止长时间超过90V以上,否则会导致铜玻璃柱变形直至破裂,甚至发生安全事故)。 
2、  待铜柱温度升至350℃左右时,加热套触摸起来比较烫,开启氢气钢瓶并形成气流,使铜柱内的铜丝还原(反应
速率很快,几秒钟见效,还原与否可以从铜丝颜色的变化看到,同时柱内会产生水蒸气,氧化铜与氢气反应所致;通氢气的时候最好打开窗户,一定熄灭操作台边上所有明火,包括酒精灯和电炉)。 
3、  待铜丝被氢气还原呈现纯紫铜铮亮色,同时把里面的水蒸气也排出完全后,关闭氢气钢瓶,压力表指针降为零;
打开氮气钢瓶,气流大小以把针头对准操作者手背5cm距离明显感觉到气流为宜,并随时注意气流是否足够。 4、  使用完毕后,先关紧氮气钢瓶,使压力表的指示针回至零位,接着关闭电源,使调压变压器调节指示回至0伏
处。 
(二)、无氧无菌水的配制 
1.         将500ml一定浓度的NaCl水溶液(防止稀释时细胞涨破)沿玻璃棒倒入固定在铁架台上的1000ml圆底烧瓶
中(选择合适的圆底烧瓶,水不可太满,否则水沸腾时容易溅出),最好放入几个防爆玻璃珠。向500ml水中加入终浓度为0.001‰的刃天青(resazurin),即加入0.5ml 的1‰刃天青母液(W/V),并加入0.25g半胱氨酸(L-Cysteine)(终浓度0.5‰)。在烧瓶外壁溶液水平面处划一刻度后,加入适量水(因为蒸发会损失部分水分)。煮沸5-10min(视所加水总量而定),刃天青会根据水中含氧量的下降经历紫色-红色-无色的颜色变化,当溶液变为无色后,再煮沸5min,然后通高纯氮气1-2min(赶走空气)。 
2.         分装的过程可以不用继续加热,用10ml的定量注射针筒抽进氮气流,再打出(三次以上)洗气,然后抽取
9ml无氧水注入已换气的15ml厌氧管中(抽取注射过程中应迅速利落,与空气接触时间应缩至最短);注入厌氧管后,需要等待通气5s-10s,以置换瓶中空气,在抽出氮气流针头的同时塞紧异丁烯橡胶塞(操作要领:抽出针头时要注意,橡胶塞应该先半扣到瓶口,然后用右手食指揿住,左手捏住通气针头慢慢抽出针头,橡胶塞可能会外翻导致漏气等,此时将针头往瓶内伸,使塞子恢复原样,有时需要反复多次,视塞子大小而定,最后拔出针头,拔出同时立即将塞子塞进管口),最后旋紧盖子。 3.         121℃高压蒸汽灭菌20min。 
(三)、专性厌氧菌液体培养基配制(以制备1000ml为例) 
1、  按照配方配制培养基,定容后,加入1ml的1‰刃天青母液(W/V)(终浓度0.001‰),0.4g的半胱氨酸(L-Cysteine)
(终浓度0.4‰),用NaOH或KOH调节pH值(resazurin和半胱氨酸对培养基的pH有影响,应加入后再测pH)。2、  制备高纯氮气,操作过程同(一);将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气,在培养基中加入5% Na2S•9H2O
溶液,使其终浓度为0.5‰,用枪吸取适量培养基注入到厌氧管(或厌氧瓶中),通气10-20S,塞上橡胶塞,旋紧盖子。 
3、  厌氧试管用牛皮筋扎成7支或者10支一捆即可灭菌,121℃湿热灭菌20min。 (四)厌氧菌固体培养基配制 1、  同(三)1。 
2、 取上述培养基注入母液圆底烧瓶中(可以预先在圆底烧瓶外壁用记号笔划上体积刻度),再
加琼脂粉和适量蒸馏水以弥补在煮沸过程中蒸发的损失量。然后煮沸15-20mins,驱除培养基中的溶解氧。(应特别注意:融化的固体培养基在沸腾时容易从烧瓶瓶口溢出引起电炉短路,从而将电炉烧坏),在接近沸腾时要把电炉移开。 
3、  煮沸10分钟后,开始通高纯氮气;将厌氧管固定到铁架台的夹子上并通氮气,加入5% Na2S•9H2O溶液,使其
终浓度为0.5‰。然后用10ml的定量注射针筒取5ml培养基注入15ml已换气的厌氧试管中。(注意:因为是固
体培养基,注射器活塞处容易被琼脂粘住,使得封闭性较高,相对来说不易变红,但是也会有少许颜色,不用担
心,同样加入少量硫化钠到管子或者瓶子内即可)。 
4、 灭菌后的培养基取出来,就进行滚管操作。使灭完菌还未冷却的固体培养基在桌面匀速滚动,
培养基会均匀固定在厌氧管壁上;也可以做成斜面状,但是如果是分菌的话应该是滚管更加好点,因为接触面积大。最后,管底会留有稍许的冷凝水。 
5、 注:如果是制备少量固体培养基,也可先在厌氧管中加入终浓度为2%的琼脂后按液体培养

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