细胞培养常用设备及实验技巧(五)细胞传代培养(消化法)

具体操作:

一. 传代前准备:

1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。

4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。

5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。

6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。

8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

二.胰蛋白酶消化:

1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞**好,**佳消化温度是37℃。

2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。

3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。

三.吹打分散细胞:

1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6~8分钟。

4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四.分装稀释细胞:

1.分装:将细胞悬液吸出分装**2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。

2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。**后要做好标记。

五.继续培养:

用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。 

传代细胞培养注意事项:

1.严格的无菌操。

2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:

EDTA 0.20g,NaCl 8.00g,KCl 0.20g,KH2PO4 0.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容**1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。

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